1. 认识环状RNA (circRNA)

环状RNA（circRNA）是一类天然存在于真核细胞中的非编码RNA或编码RNA，其3'端和5'端通过共价键连接形成一个完整的闭合环状结构。与我们熟知的线性RNA（如mRNA）不同，circRNA没有游离的5'端帽子结构和3'端poly(A)尾巴。这种独特的结构赋予了circRNA诸多优越的特性：

• 高度稳定性： 由于缺乏游离末端，circRNA能够抵抗核酸外切酶（如RNase R）的降解，因此在细胞内和体外的半衰期远长于线性RNA。这使得circRNA在发挥生物学功能或作为药物时，能够更持久地存在和作用。
• 表达调控潜力： circRNA的生成过程（反向剪接）本身就是一种精密的调控机制，其表达水平在不同组织、细胞类型、发育阶段及疾病状态下具有特异性。
• 多样的生物学功能： circRNA可以通过多种机制参与基因表达调控，如作为microRNA（miRNA）海绵、与RNA结合蛋白（RBP）相互作用、调控转录和剪接，甚至在特定条件下可以翻译产生蛋白质或多肽。

自20世纪70年代首次在病毒中被发现，并在随后在真核细胞中被证实广泛存在以来，circRNA的研究在过去十年中取得了爆发式进展。特别是随着高通量测序技术和生物信息学的发展，大量circRNA被鉴定出来，其在生命活动和疾病发生发展中的重要作用逐渐被揭示，使其成为生命科学研究的前沿和热点。

2. 环状mRNA的生物学功能

尽管许多circRNA属于非编码RNA，但其在细胞内的功能却不容小觑。近年来，越来越多的研究表明，经过特殊设计的环状mRNA（携带开放阅读框ORF和内部核糖体进入位点IRES）能够有效地翻译成蛋白质。其主要的生物学功能和机制包括：

• miRNA海绵（miRNA Sponge）： 这是circRNA研究最为广泛的功能之一。circRNA分子上可以包含多个miRNA结合位CEC（miRNA response elements, MREs），能够像海绵一样吸附特定的miRNA分子，从而解除这些miRNA对其靶基因mRNA的抑制作用，间接上调靶基因的表达。例如，ciRS-7（CDR1as）能够高效吸附miR-7。
• 与蛋白质相互作用： circRNA可以作为动态支架，与多种RNA结合蛋白（RBPs）或其他蛋白质相互作用，调控这些蛋白质的活性、定位或稳定性，进而影响细胞的多种生命过程，如剪接、转录、细胞周期调控等。
• 调控基因转录和剪接： 一些在细胞核内富集的circRNA（如EIciRNA，即外显子-内含子circRNA）可以直接或间接地调控其亲本基因的转录。它们可以与RNA聚合酶II复合物相互作用，增强基因的转录活性，或者影响可变剪接过程。
• 翻译成蛋白质/多肽： 尽管circRNA通常被认为是“非编码”的，但越来越多的证据表明，部分内源性circRNA或经过工程化改造的circRNA，在其序列中包含内部核糖体进入位点（IRES）或m6A修饰时，能够被核糖体识别并翻译成具有生物学活性的蛋白质或多肽。这为circRNA作为新型蛋白质表达工具和基因治疗载体开辟了新途径。
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3. 环状mRNA的应用前景

鉴于circRNA的独特性质和多样的生物学功能，其在生物医药领域的应用前景十分广阔，尤其在以下几个方面展现出巨大潜力：

• 新型疫苗开发： 环状mRNA疫苗被认为是下一代RNA疫苗的有力竞争者。与线性mRNA疫苗相比，circRNA疫苗具有更高的稳定性，能够在体内持续表达抗原更长时间，从而诱导更强、更持久的免疫应答。此外，其生产过程中可能不需要复杂的加帽和加尾步骤，并可能具有较低的固有免疫原性。北京大学魏文胜团队等已在新冠病毒circRNA疫苗研究中取得了突破性进展（如circRNARBD-Delta），证实了其广谱保护潜力。
• 基因治疗与药物开发：
  • 蛋白质替代疗法： 对于因基因缺陷导致的蛋白质功能丧失性疾病，可以设计表达特定蛋白质的circRNA，通过其高效、持久的蛋白质表达特性，作为一种新的治疗策略。例如，Orna Therapeutics公司致力于开发超长circRNA用于治疗杜氏肌营养不良（DMD）等疾病。
  • 疾病调控： 利用circRNA作为miRNA海绵或调控蛋白相互作用的特性，可以开发靶向特定circRNA或利用工程化circRNA来干预疾病相关的信号通路，用于癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等的治疗。
• 诊断标志物： circRNA在血液、尿液、唾液等体液中稳定存在，且其表达谱在不同疾病状态下（如癌症）会发生特异性改变，这使其成为极具潜力的非侵入性疾病诊断和预后生物标志物。
• 科学研究工具： circRNA的稳定性和多功能性使其成为研究基因功能、细胞信号通路和疾病机制的有力工具。

4. 环状mRNA的制备技术

高效、高纯度地制备环状mRNA是其走向应用的关键。目前，环状mRNA的制备方法主要分为体外合成和细胞内表达两大类，其中体外合成因其可控性高、产量大、周期相对较短而受到广泛关注。

4.1. 线性RNA前体的设计与合成

无论是哪种环化策略，首先都需要获得线性的RNA前体。该前体通常包含以下关键元件：

• 目标序列（ORF）： 如果期望circRNA翻译产生蛋白质，则需要包含编码目标蛋白的开放阅读框。
• 内部核糖体进入位点（IRES）： 对于需要翻译的circRNA，IRES元件是必不可少的，它能够不依赖5'端帽子结构招募核糖体启动翻译。常用的IRES序列来源于病毒（如EMCV、CVB3）或细胞基因。
• 侧翼环化序列/元件： 根据所选的环化方法，线性前体的两端需要设计特定的序列或结构元件，以介导高效的环化反应。例如，用于酶法连接的互补序列，或用于核酶催化的内含子/外显子序列。
• 间隔序列（可选）： 有时会加入适当的间隔序列以优化环化效率或蛋白质表达。

线性RNA前体通常通过体外转录（In Vitro Transcription, IVT） 技术合成。以DNA质粒或PCR产物为模板，在RNA聚合酶（如T7、T3或SP6 RNA聚合酶）的作用下，将核糖核苷三磷酸（NTPs）合成为单链RNA。IVT过程可以进行优化，例如通过引入修饰性核苷（如假尿苷酸 N1-methylpseudouridine, m1Ψ）来降低RNA的免疫原性并提高翻译效率，尽管对于circRNA是否普遍需要修饰尚在研究中。

4.2. 体外环化策略

获得线性RNA前体后，关键步骤是将其两端连接起来形成环状结构。主要的体外环化方法包括：

• 酶促连接法（Enzymatic Ligation）：

  • T4 RNA Ligase介导的连接： T4 RNA Ligase 1或T4 RNA Ligase 2可以将单链RNA的5'-磷酸末端和3'-羟基末端连接起来。为了提高分子内环化的效率，通常需要较低的RNA浓度以减少分子间连接。
  • 夹板辅助连接（Splint Ligation）： 使用一条与线性RNA前体两端互补的短DNA或RNA寡核苷酸（splint oligo）作为桥梁，将RNA前体的两端拉近，然后通过DNA连接酶（如T4 DNA Ligase，如果splint是DNA且RNA末端有相应修饰）或RNA连接酶进行连接。这种方法可以提高环化特异性和效率。专利CN107267499A中描述了利用splint进行环状DNA或RNA制备的方法，通过逐次加入法可以显著提高产率。

• 核酶介导的环化（Ribozyme-mediated Cyclization）：

  • 自身剪接核酶（Self-splicing Ribozymes）： 利用某些天然存在的核酶（如I型或II型内含子）的自身剪接和连接活性。
    • 置换内含子-外显子（Permuted Intron-Exon, PIE）系统： 这是目前应用最广泛的circRNA体外合成策略之一。将目标RNA序列（外显子）插入到经过特定设计的内含子序列中，形成线性前体。在特定条件下（如加入Mg²⁺和鸟苷酸），内含子序列会发生两步连续的转酯反应，首先进行5'端剪切，然后进行3'端剪切并将两侧的外显子序列（即目标RNA序列）连接成环，同时释放出线性的内含子。云舟生物、耀海生物等公司均提及基于PIE系统的高效环化平台。
    • II型内含子（Group II Introns）： 某些细菌II型内含子也可以在体外催化RNA的环化。
  • 连接酶核酶（Ligase Ribozymes）： 一些人工设计或筛选得到的核酶（如RzL）可以直接催化RNA链的连接成环。台湾国家卫生研究院的研究团队便开发了利用顺式作用的连接酶核酶(RzL)将线性RNA环化的方法，显著提升了纯度与效率。

4.3. 细胞内表达策略

除了体外合成，也可以通过在细胞内表达载体来生产circRNA。通常是将编码目标circRNA的序列克隆到特制的表达质粒中，该质粒包含能够促进反向剪接的侧翼序列（如互补的Alu重复序列或其他内含子序列）以及强启动子。转染细胞后，细胞内的剪接机制会识别这些信号，将转录产物加工成环状RNA。广州艾基生物的技术服务中提到了环状RNA载体的构建，其载体上含有独家研发的上下游环化框架，保证环化效率。

4.4. 纯化与质量控制

无论是体外合成还是细胞内表达，获得的粗产物中都可能含有未环化的线性RNA、降解片段、酶、盐离子以及其他副产物。因此，高效的纯化和严格的质量控制对于获得高纯度、高活性的circRNA至关重要。

• 纯化方法：

  • RNase R处理： RNase R是一种3'→5'核酸外切酶，能够特异性降解线性RNA，而对具有套索结构或环状结构的RNA（因缺乏游离3'端）具有抗性。这是区分和纯化circRNA的常用方法。
  • 高效液相色谱（HPLC）： 基于分子大小、电荷或疏水性的差异，HPLC可以有效分离环状RNA和线性RNA及其他杂质，获得高纯度的circRNA。合信成生物在其“Endless Column Χ Endless RNA”系统中可能就采用了先进的色谱纯化技术，实现基线分离。
  • 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： PAGE可以根据分子大小分离不同形式的RNA，可用于分析和纯化。
  • 磁珠纯化： 利用特定的亲和标签或捕获探针进行纯化。

• 质量控制（QC）：

  • 完整性与纯度检测： 通过变性琼脂糖凝胶电泳或PAGE电泳、毛细管电泳（如Agilent Bioanalyzer）、HPLC等检测circRNA的大小、完整性和纯度。
  • 环化效率确认： 通过与RNase R处理前后的样品进行比较，评估环化效率。
  • 序列验证： 通过Sanger测序或高通量测序确认环状RNA序列的准确性。
  • 浓度测定： 使用紫外分光光度计（如NanoDrop）或荧光染料法（如Qubit）测定浓度。
  • 内毒素检测： 对于用于细胞或动物实验，特别是计划用于临床应用的circRNA，必须进行严格的内毒素检测和控制。
  • 翻译活性验证（如适用）： 通过体外翻译实验或细胞转染后检测蛋白表达，验证编码型circRNA的翻译能力。

合信成生物在其宣传中强调其技术能够达到研究级纯度（>85%）和药物研究级纯度（>95%），并能进行大规模制备（如10mg级别一周内完成，最高达100mg以上），这体现了其在纯化和规模化生产方面的优势。

5. 挑战与未来展望

尽管circRNA的制备技术和应用研究取得了显著进展，但仍面临一些挑战：

• 环化效率的进一步提升： 虽然现有方法已能较好地制备circRNA，但对于特定序列或超长序列，环化效率仍有提升空间。
• 规模化生产与成本控制： 要满足临床应用的需求，需要进一步优化生产工艺，降低成本，实现大规模、符合GMP标准的生产。
• 递送系统的开发： 与其他核酸药物类似，如何将circRNA高效、特异性地递送到靶细胞或组织，是其临床转化的关键瓶颈。LNP（脂质纳米颗粒）是目前常用的递送系统，但仍需探索更优的递送策略。
• 安全性和免疫原性评估： 需要全面评估不同类型circRNA及其递送系统的长期安全性和潜在免疫原性。
• 作用机制的深入理解： 对于许多circRNA的精确生物学功能和作用机制仍需进一步探索，这将为合理设计和应用circRNA提供理论基础。

展望未来，随着对circRNA生物学认识的不断深入和制备技术的持续革新，环状mRNA有望在以下方面取得更大突破：

• 个性化肿瘤疫苗和免疫治疗。
• 罕见病和遗传病的基因替代疗法。
• 针对复杂疾病（如神经退行性疾病、代谢性疾病）的新型治疗策略。
• 更精准的疾病诊断和预后监测工具。

环状mRNA以其独特的结构优势和多样的生物学功能，为核酸药物和疫苗的研发开辟了全新的道路。从高效的体外制备技术（如PIE系统、酶促连接）到严格的纯化与质控流程，再到广阔的应用前景（尤其在疫苗和基因治疗领域），circRNA正展现出其作为下一代生物医药明星分子的巨大潜力。如合信成生物等公司在circRNA规模化、高纯度制备方面的技术积累，将有力推动环状mRNA从基础研究走向临床应用，为人类健康事业贡献新的力量。可以预见，随着技术的不断成熟和研究的深入，环状mRNA必将在未来的生物医药领域大放异彩，引领新一轮的创新浪潮。