概述

实时荧光定量 PCR（qPCR）不仅可以检测样品中目标核酸的存在，还能对其数量进行精确定量。根据定量过程是否依赖已知浓度的标准品，qPCR 定量可分为“绝对定量”与“相对定量”两种主要模式。绝对定量旨在测定样品中靶标分子的绝对拷贝数，而相对定量则重点关注不同实验组之间目标基因表达水平的相对差异。

绝对定量的原理与方法

2.1 数字 PCR 法（Digital PCR）

数字 PCR（dPCR）通过将待测样品分配到数万个独立的反应体系中，在每个小反应中仅含有零个或单个靶分子。扩增结束后，每个反应孔的信号被判定为“阳性”（含有至少一个靶分子）或“阴性”（不含靶分子）。根据泊松分布原理，通过阳性孔与总孔数的比例即可准确推算出样品中靶分子的绝对拷贝数，而无需外部标准品或内源性对照。

关键要点

1. 分区和判读：样品需经过充分混匀后平均分配到所有反应单元中，并确保荧光信号判读准确无误。

2. 样品损失控制：由于 dPCR 强调有限稀释检测，任何因试管或移液器吸附导致的样品损失都将显著影响定量结果，需使用低吸附材料进行稀释与移液。

3. 适用场景：dPCR 对检测低拷贝或样品复杂背景（如混合等位基因、稀有突变）具有较高灵敏度和精确度，但成本和设备要求相对较高。

2.2 标准曲线法

标准曲线法是最常见的绝对定量方式。其原理是：首先准备一系列已知浓度的标准品（如质粒 DNA 或体外转录 RNA），经过精确稀释后在同一实验条件下进行 qPCR 扩增，获得相应的循环阈值（Ct）值，并根据 Ct 与已知拷贝数绘制标准曲线。待测样品在相同反应体系下获得 Ct 后，即可通过标准曲线转换得到其绝对拷贝数。

关键要点

1. 标准品制备：标准品必须来源于纯净、可准确测定浓度的单一物种，避免污染。例如，质粒 DNA 需经过 RNase 处理以去除 RNA 干扰，否则 A260 测量值可能偏高，导致拷贝数计算错误。

2. 精确稀释：标准品浓缩后需进行 10^6–10^12 倍顺序稀释，以覆盖样品中可能出现的浓度范围。多次稀释过程中必须使用精密移液器，并采用低吸附管进行操作。

3. 标准曲线绘制与验证：标准曲线应至少包含五个浓度梯度，保证线性范围广且回归系数（R²）接近 1。若回归系数过低，需排查稀释或扩增效率问题。

4. 样品稳定性：尤其是 RNA 标准品，对温度和冻融敏感。应分装至多份保存在 –80 °C，使用前再解冻并尽快使用以减少降解。

5. 效率和线性范围：理想的扩增效率应在 90%–110% 之间，曲线斜率接近 –3.3。若效率低于 90% 或超过 110%，需调整引物设计、模板质量或反应条件。

相对定量的原理与方法

相对定量旨在比较不同实验组或处理条件下相同靶基因的表达水平变化，通常以某一对照样品作为“校准品”或“参照组”，并利用内源性对照（常用管家基因）进行信号归一化，最终获得待测基因在不同样品中的相对表达量。

3.1 标准曲线法（用于相对定量）

相对定量的标准曲线法与绝对定量类似，但标准曲线的目的是保证靶基因和内源性对照基因的扩增效率相当。在不同反应管中分别对靶基因与内源性对照进行扩增，并绘制两者各自的标准曲线。待测样品的 Ct 值通过各自标准曲线转换为“相对量”，随后将靶基因相对量除以内源性对照相对量，得到归一化值。再用归一化后的值与校准品进行比值比较，最终获得相对表达量。

关键要点

1. 内源性对照选择：常用的管家基因包括 β-肌动蛋白、GAPDH、18S rRNA 等。要求其表达在各处理组中相对稳定，否则会影响归一化结果。

2. 效率验证：靶基因和内源性对照基因的标准曲线斜率应相近（理想差异不超过 0.1），以保证两者扩增效率一致。

3. 重复与稳定性：每个样品和对照应至少做三次技术重复，以减小实验误差。

4. 结果表达：归一化后的靶基因表达量与校准品相比，若数值大于 1 表示上调，小于 1 表示下调，通常用 2^–ΔΔCt 或直接比值法来计算。

3.2 比较 Ct 法（ΔΔCt 法）

比较 Ct 法（ΔΔCt 法）是在同一孔内同时扩增靶基因和内源性对照基因（双标记 qPCR），通过 Ct 值差异直接计算相对表达量，省去标准曲线绘制步骤。具体步骤如下：

1. 计算 ΔCt：ΔCt = Ct(靶基因) – Ct(内源性对照)。

2. 计算 ΔΔCt：ΔΔCt = ΔCt(待测样品) – ΔCt(校准品)。

3. 相对表达量：2^–ΔΔCt 表示待测组相对于校准组靶基因表达的倍数变化。

关键要点

1. 效率匹配：靶基因与内源性对照的扩增效率应接近，否则 2^–ΔΔCt 计算结果会失真。

2. 同管扩增：在同一反应体系中混合两对引物与探针，可减少移液误差，提升通量。但需优化引物浓度，避免不同通道之间的竞争影响 Ct 值。

3. 数据解读：ΔΔCt 法适用于基因表达变化幅度较大且对效率要求相对宽松的场景，操作简便、通量高，但不适合需要获取绝对拷贝数或变化幅度较小的定量需求。

方法选择与比较

在实验设计阶段，需结合研究目的、样品特性及资源情况选择合适的定量方式。以下从各方面进行对比与建议：

1. 若需精准获取样品中靶基因或病原核酸的绝对拷贝数，且可接受设备与耗材成本，可优先考虑数字 PCR 法。

2. 若研究重点在于某基因拷贝数与临床/生物学指标相关性，如病毒载量监测，可采用标准曲线法进行绝对定量，并结合其他临床信息进行关联分析。

3. 若研究关注基因表达差异（如药物处理、时间梯度实验），且样品量较大，可选用比较 Ct 法以节省时间与成本，当对结果可靠性要求更高时，再结合标准曲线验证部分样品。

4. 若同时需要绝对拷贝数与相对表达比较，可在同一次实验中设置部分孔用于标准曲线绘制、部分孔用于样品检测，以获得更全面的数据支撑。

常见注意事项与实践建议

1. 实验设计与生物学重复：无论采用哪种定量方式，都建议至少进行三次技术重复和三次生物学重复，保证实验结果的稳定性与可重复性。

2. 引物/探针优化：引物特异性与扩增效率对定量结果影响巨大，应在实验前进行熔解曲线分析、凝胶电泳验证等，确保无非特异产物。

3. 样品质量与纯度：RNA 样品需无明显降解，OD260/280 值在 1.8–2.0；DNA 样品需保证无蛋白、盐离子及有机溶剂残留。

4. 内源性对照选择：相对定量时，管家基因表达应在各处理组中稳定；如遇处理条件影响管家基因表达，可尝试多基因联合归一化或外源性对照法。

5. 数据分析与统计学处理：定量数据通常呈对数分布，可先进行 log 转换后再进行统计学检验（如 t 检验、ANOVA），以保证数据符合正态分布假设。

6. 报告结果时注明方法：在发表论文或报告实验数据时，应明确说明所采用的定量方法（如 dPCR、标准曲线或 ΔΔCt），并报告扩增效率、曲线斜率、R² 值等关键参数。

qPCR 技术在生命科学研究及临床诊断领域中被广泛应用，其定量结果的准确性直接影响下游结论。当面临不同研究需求时，需根据样品类型、实验目的以及实验室资源合理选择绝对定量或相对定量方法。数字 PCR 提供了无需标准品即可获得高精度绝对拷贝数的可能；标准曲线法则兼具灵活性，可用于绝对拷贝数或相对表达量；比较 Ct 法则以高通量与简便性见长，但需注意效率匹配。综合比较各方法的优缺点与实验要求，可在设计阶段为您的 qPCR 实验打下坚实基础，从而获得可靠、可重复的定量结果，并最终为科研或临床应用提供有力支持