聚合酶链式反应（PCR）具有高灵敏度和高特异性，但因其对微量DNA的极强扩增能力，实验室中极易发生扩增产物的交叉污染或“前PCR产物”污染，导致假阳性结果。基于尿嘧啶-DNA糖苷酶（UDG，又称UNG）体系的污染预防策略，通过在PCR产物中掺入含尿嘧啶嘌呤（dUTP）并在扩增前利用UDG特异性切除含尿嘧啶的DNA残留，从而有效消除前次扩增残留的污染模板，确保实验准确性。本文系统阐述了UDG/UNG防污染的原理、实验室实施流程、关键试剂和仪器配置、优化要点及常见问题排查，为PCR实验室建立一套可靠且高效的污染防控体系提供技术指南。 

1. 引言

PCR技术自1985年问世以来，因其可以在短时间内对目标序列进行指数级扩增，已成为分子生物学、临床诊断、法医鉴定等领域的核心工具。然而，扩增产物一旦残留在试剂、移液枪头或实验环境中，即可在后续反应中被放大，形成“carry‑over”污染，严重影响数据可靠性。早期研究表明，来自前一次PCR的微量扩增产物是PCR假阳性的主要来源之一，需要建立有效的防污染策略来确保实验结果的可信度。

2. UDG/UNG的酶学原理

2.1 UDG/UNG家族概述

尿嘧啶-DNA糖苷酶（UDG）是一类高度保守的DNA修复酶，能够识别双链或单链DNA中被错误掺入的尿嘧啶（dU），并通过催化N-糖苷键的水解将其从脱氧核糖骨架上切除，生成无碱基位点（AP位点），使含dU的DNA链在碱性条件下断裂并降解。其中，家族I UDG酶通常称为UNG，两者在PCR防污染应用中的功能无本质区别。

2.2 防污染机制

防污染策略关键在于两步：

1. 扩增体系中将常规的脱氧胸苷三磷酸（dTTP）部分或全部替换为脱氧尿苷三磷酸（dUTP），使所有新合成的PCR产物内含尿嘧啶。

2. 在后续PCR启动前，先在50℃条件下加入UDG酶孵育，使残留的含dU的扩增产物在第一个退火或延伸步骤前被切除并降解，原始天然模板（不含dU）不受影响；随后通过高温变性（>95℃）使UDG失活，随后进行正常的DNA扩增。

3. 实验材料与试剂

• UDG酶：来源可为大肠杆菌表达的常温型或热不稳定型UDG，需具有在50–55℃活性并能在95℃失活的特性。

• dUTP：与dTTP兼容，用于替换扩增体系中部分或全部的脱氧胸苷三磷酸。

• DNA聚合酶：对dUTP不敏感，常用Taq或高保真酶系。

• PCR缓冲液、Mg²⁺、引物及模板DNA：常规配置。

• 无RNA酶/无DNA酶水，移液枪头（带滤芯），一次性PCR管：保证操作过程无其他DNA污染。

4. UDG/UNG防污染实验流程

1. 配制含dUTP的PCR混合液

   • 将原有dTTP浓度按比例（如100%或50%）替换为等摩尔的dUTP。

   • 添加预定量的UDG酶（通常为2–5 U/反应）于混合液中。

2. UDG预孵育

   • 将反应管置于热循环仪，50℃孵育2–10分钟，使残留含dU的DNA产物被切除。

3. UDG失活及DNA变性

   • 将温度升至95℃保持2分钟，以使UDG酶完全失活，并进行首次DNA链变性。

4. 常规PCR扩增

   • 按设定的循环条件（退火、延伸）执行扩增，UDG失活后不会影响新合成的dU‑DNA产物。

5. 产物检测

   • 扩增结束后，可进行电泳、实时定量检测或下游克隆、测序等分析。

5. 关键优化要点

1. dUTP替换比例

   • 全部替换可最大程度防污染，但部分替换可平衡酶活性及扩增效率。

2. UDG酶量与孵育时间

   • 酶量过低或孵育不足会导致残留污染，酶量过高或孵育过长可能影响目标模板（若含天然dU）。

3. 热不稳定UDG的选择

   • 热不稳定型UDG在50–55℃活性，同时在95℃迅速灭活，减少对扩增步骤的干扰，适用于一体化、简化操作流程。

4. 引物设计

   • 引物内部含dA比含dU更易被UDG切除。若引物尾端含dU，则不会被UDG切除，应避免在3′末端使用dU。

5. 退火温度设置

   • 因UDG在55℃以下可能仍有残留活性，建议PCR退火温度不低于55℃，以免新合成dU‑DNA在延伸阶段被切割。

6. 常见问题与排查

7. 应用场景与局限性

• 常规PCR及实时PCR：最常见，用于常规核酸检测和定量实验中防止交叉污染。

• 法医、环境和公共卫生检测：对假阳性容忍度极低，需要可靠防污染措施的场景。

• 限制一体化RT-PCR与嵌套PCR：因反转录或二次扩增均可能掺入dU，UDG体系需谨慎使用或分步操作。

• 甲基化检测（亚硫酸盐处理）：模板中尿嘧啶大量出现，UDG会误切除，故不适用。

8. 讨论与替代方案

除UDG/UNG外，还可结合以下策略进一步提升实验室防污染水平：

• 物理隔离：将设置预处理区、扩增区和产物分析区，分区操作，使用不同移液器与耗材。

• 紫外线照射：对实验台面和移液枪头进行255 nm紫外线照射，破坏DNA。

• 一次性耗材：统一使用带滤芯的移液枪头和一次性耗材，减少擦拭和清洗带来的二次污染。

• 负对照设置：每批PCR都设无模板对照，实时监控污染状态。

9. 结论

UDG/UNG防污染策略通过将dTTP替换为dUTP并利用UDG酶在扩增前特异性切除残留含dU的PCR产物，能在不影响新合成DNA的前提下显著降低假阳性率。结合严格的实验室分区管理、紫外线或化学清洁以及合适的对照设计，可建立一套高效、可靠且易于推广的PCR污染防控体系，保证分子实验结果的准确性。建议在常规PCR实验中将UDG/UNG策略作为首选手段，并根据具体实验需求优化dUTP替换比例和UDG处理条件。