实时荧光定量PCR（qPCR）因其高灵敏度、高特异性和定量能力，已成为新型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）检测的金标准。为了保证检测结果的准确性，对样本中的病毒核酸模板进行充分、可靠的前处理至关重要。本文以新冠病毒qPCR检测为例，从样本采集与转运、病毒灭活与裂解、核酸提取、质量评估、逆转录及qPCR体系配置五个方面，系统阐述模板前处理的技术要点、实验流程、注意事项及优化策略，为临床和科研实验室构建高效、稳定的qPCR检测体系提供参考指导。

1. 样本采集与转运

1.1 样本类型与用途

• 呼吸道样本：鼻咽拭子、咽拭子、唾液、痰液等；

• 血液样本：全血、血清或血浆，主要用于血症监测；

• 其他样本：粪便、尿液、组织活检等，根据研究或临床需求选取。

1.2 采集流程

1. 佩戴防护：采样人员须穿戴符合生物安全三级（BSL‑3）或二级（BSL‑2+）要求的防护装备，包括防护服、N95口罩、面罩及一次性手套。

2. 拭子采样：

   • 打开无菌拭子包装，分别取鼻咽和/或咽拭子，插入对应部位旋转3—5圈，避免接触唇、舌等非目标部位。

   • 将拭子缓慢取出，放入含病毒保存液的无RNA酶管中折断拭子柄，拧紧管盖。

3. 唾液/痰液采集：让受检者将唾液自行吐入采样管中，或诱导咳痰。

1.3 样本标记与信息记录

• 贴上唯一条形码或编号，记录采样日期、编号、采集部位及采样人员信息，确保样本全程可追溯。

1.4 运输与保存

• 低温运输：样本在2–8 ℃条件下保存，运输时间应≤24 h；超出24 h或远距离运输，建议使用−70 ℃冷冻干冰快递。

• 分区管理：样本接收区、预处理区与分析区严格分离，防止交叉污染。

2. 病毒灭活与细胞裂解

2.1 化学灭活

• 裂解缓冲液：含去污剂（如SDS、Triton X‑100 等）、蛋白酶抑制剂和EDTA，可同时实现病毒膜破裂和核酸保护。

• 添加比例：按体积比（样本：裂解液）1∶1—1∶3，混匀后室温孵育5–10 min。

2.2 热灭活

• 温度与时间：56 ℃孵育30 min 或 65 ℃孵育15 min，能有效失活脂膜病毒；

• 注意事项：高温处理可能导致RNA降解，故仅在必要时采用，建议结合化学裂解。

2.3 放射灭活（仅限特定实验室）

• 使用γ射线或紫外线照射，需在独立设施中操作，不推荐常规临床实验室使用。

3. 病毒核酸提取

3.1 提取方法概览

1. 硅胶膜柱法：利用RNA与硅胶基质在高盐条件下结合，依次洗涤后以低盐或水洗脱；

2. 磁珠法：磁性颗粒包裹的硅基或聚合物基质同样依赖高盐结合，利用磁力分离瓶颈，可实现自动化提取；

3. 三氯甲烷/酚–氯仿法：经典的有机溶剂分离法，需严格防护并多次离心，耗时且易污染，现代实验室已很少使用。

3.2 样本预处理

• 离心去除细胞碎片：4 000 ×g 离心5 min，转上清用于提取；

• 加入等体积的裂解液+蛋白酶K，56 ℃孵育10–15 min；

3.3 结合与洗涤

• 将裂解液与结合缓冲液混匀后上柱或与磁珠孵育，使RNA粘附；

• 依次使用低浓度酒精洗脱杂质，再用高浓度酒精或乙腈彻底洗涤；

3.4 RNA洗脱

• 使用无RNA酶水或低盐洗脱缓冲，以30–50 µL体积洗脱RNA；

• 洗脱温度可设为37 ℃以提高回收率，静置1–2 min后收集。

3.5 自动化与高通量

• 磁珠法具备与液体处理系统（自动化工作站）兼容的优势，可批量处理96孔板，显著提高通量和一致性。

4. 核酸质量评估

4.1 浓度与纯度检测

• 分光光度法：260/280 nm 比值 1.8–2.0 表示较纯；260/230 nm 比值 2.0–2.2 表示无有机污染；

• 荧光染料法：使用特异性RNA荧光试剂（如PicoGreen）定量更灵敏。

4.2 完整性检测

• 凝胶电泳：在非变性琼脂糖凝胶中观察rRNA条带是否清晰；

• 芯片分析：生物分析仪可给出RNA完整性数值（RIN ≥7 推荐用于高精度实验）。

4.3 抑制剂检测

• 内部对照：在qPCR体系中加入外源RNA/DNA对照，若Ct值偏高或不稳定，则可能存在抑制剂；

• 稀释法：将RNA样本进行二倍或四倍系列稀释，若Ct值变化正常，则说明抑制剂浓度较低。

5. 逆转录与qPCR体系配置

5.1 一步法 vs. 二步法

• 一步法：逆转录和qPCR在同一管完成，操作简便、减少污染风险，但灵敏度或特异性稍逊；

• 二步法：先逆转录合成cDNA，再做qPCR，灵敏度和灵活性更高，但操作增多，污染风险上升。

5.2 引物与探针设计

• 选择SARS‑CoV‑2 保守区域（如N基因、E基因、RdRp基因）；

• 引物长度 18–25 nt，Tm 在58–62 ℃，扩增片段长度 70–200 bp；

• 探针（双标记MGB或TaqMan）长度 20–30 nt，Tm 比引物高约8–10 ℃；

5.3 逆转录条件

• 温度：42–50 ℃，30–60 min；

• 酶：热稳逆转录酶，耐高温可减少二级结构影响；

• 引物：随机引物、Oligo(dT) 或基因特异性引物，根据实验特点选择。

5.4 qPCR循环参数

1. 热启动变性：95 ℃ 2–3 min；

2. 循环（40–45 轮）：

   • 95 ℃ 10–15 s（变性）；

   • 55–60 ℃ 30–60 s（退火/延伸，同时采集荧光信号）。

5.5 反应体系优化

• Mg²⁺浓度：1.5–3.0 mM；

• dNTP：200 µM each；

• 酶量：根据酶活力优化，一般1–2 U/reaction；

• 引物浓度：200–500 nM，引物与探针比为1∶1。

6. 实验室污染防控

6.1 分区管理

• 预处理区：样本处理、核酸提取；

• 试剂配置区：qPCR混合物配制；

• 扩增检测区：PCR上机及结果分析；

6.2 仪器与耗材

• 各区专用移液器和滤芯枪头；

• 定期紫外线照射和化学消毒（含漂白剂）；

• 垃圾分类回收，PCR产物与样本废弃物分开处理。

6.3 对照与验证

• 无模板对照（NTC）：监测体系污染；

• 阳性对照：确保体系灵敏；

• 内参基因：监测样本质量；

• 定期进行体系性能验证（灵敏度、特异性、重复性）。

7. 常见问题与故障排查

8. 数据分析与结果判读

1. Ct值判定：Ct < 35判定阳性，35–40需结合曲线形态及重复实验；

2. 标准曲线定量：使用已知拷贝数的标准品绘制Ct‑log浓度标准曲线，评估效率（90–110%）与线性（R² ≥ 0.99）；

3. 阴性与阳性：需同时符合对照要求，无模板对照阴性、阳性对照阳性；

9. 质量控制与实验室认证

• ISO 15189 及 ISO/IEC 17025：临床和检测实验室常见管理体系；

• CAP/CLIA：特别针对美国临床实验室；

• 定期参加外部质量评估（EQA/Proficiency Testing），保证检测持续可靠。

10. 结论与展望

通过规范的样本采集与转运、有效的病毒灭活与细胞裂解、优化的核酸提取、严格的质量评估以及合理的逆转录与qPCR体系配置，可构建一套高效、灵敏、特异的新冠病毒qPCR检测流程。未来可结合数字PCR、多重荧光探针和微流控芯片技术，进一步提高检测通量和精度，并将检测流程向简便、现场化方向发展，以应对公共卫生应急需求。