引言

定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）作为分子生物学中的核心技术，因其高灵敏度、高特异性和实时检测能力，广泛应用于基因表达分析、病原体检测和遗传变异研究。自新冠疫情爆发以来，qPCR成为新冠病毒核酸检测的金标准，其快速、准确的特点在疫情防控中发挥了关键作用。然而，qPCR实验的成功与否，很大程度上依赖于引物和探针的设计、稀释与使用是否得当。

引物和探针是qPCR反应的核心试剂，直接决定了扩增效率和检测特异性。新冠检测中，针对SARS-CoV-2的特异性引物探针（如N基因、ORF1ab区域）已成为行业标杆，但其稀释和使用过程中的细节往往被忽视。不当的稀释可能导致假阴性或假阳性结果，影响检测可靠性。本文将系统介绍qPCR引物探针的稀释方法、使用技巧，并结合新冠检测中的常见引物探针，探讨如何优化实验流程，确保结果的准确性和重现性。

2.qPCR引物探针的基本原理

2.1 引物与探针的作用

qPCR通过实时监测荧光信号，定量检测目标核酸的含量。引物（Primers）是一对短链寡核苷酸（通常18-30 bp），分别与模板DNA或cDNA的正反链结合，指导Taq聚合酶进行扩增。探针（Probe）则是一段带有荧光报告基团（如FAM）和猝灭基团（如BHQ）的寡核苷酸，通过与目标序列特异性杂交，在扩增过程中释放荧光信号，实现定量检测。

常见的探针类型包括：

TaqMan探针：5'端标记荧光团，3'端标记猝灭团，依赖5'核酸外切酶活性。

分子信标（Molecular Beacon）：发夹结构，扩增时打开释放荧光。

SYBR Green染料：非特异性结合双链DNA，成本低但特异性较差。

2.2 qPCR的工作流程

qPCR包括以下步骤：

1. 变性：94-95°C，模板DNA解链。

2. 退火：55-65°C，引物和探针与模板结合。

3. 延伸：72°C，Taq酶催化扩增并切割探针，释放荧光。 循环上述步骤，荧光强度随扩增产物增加而增强，Ct值（循环阈值）反映初始模板浓度。

引物探针的浓度、质量和稳定性直接影响退火效率和荧光信号的可靠性，因此其稀释与使用是实验成功的关键环节。

3.引物探针的稀释方法

3.1 引物探针的初始状态

引物和探针通常由供应商以冻干粉形式提供，浓度单位为nmol。收到后需用无核酸酶水（Nuclease-Free Water）或TE缓冲液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）复溶至储备浓度（如100 μM），然后分装冷冻保存。

复溶步骤：

1. 检查供应商提供的引物探针量（如10 nmol）。

2. 计算复溶体积：若目标浓度为100 μM，则体积（μL）= nmol × 10。例如，10 nmol复溶至100 μL，得100 μM储备液。

3. 加入适量无核酸酶水，轻轻涡旋混匀，避免剧烈振荡破坏寡核苷酸。

3.2 工作浓度的稀释

qPCR反应中，引物和探针的工作浓度通常为：

引物：0.1-1 μM（常用0.2-0.4 μM）。

探针：0.05-0.25 μM（常用0.1-0.2 μM）。 

稀释示例：

目标：从100 μM储备液配制10 μM工作液，体积200 μL。

计算：C1V1 = C2V2，100 μM × V1 = 10 μM × 200 μL，V1 = 20 μL。

操作：取20 μL 100 μM储备液，加入180 μL无核酸酶水，混匀，得10 μM工作液。

进一步稀释：从10 μM配制0.4 μM引物（反应体系用），取4 μL 10 μM液，加96 μL水，得100 μL 0.4 μM液。 

注意事项：

使用滤芯吸头，避免污染。

稀释后立即使用或短期存放于4°C，长期保存于-20°C，避免反复冻融（建议分装<10次）。

3.3 批量稀释与储存

为高通量检测（如新冠筛查），可配制引物探针混合液。例如，配制100次反应份的引物探针Mix：

每反应引物0.4 μM、探针0.2 μM，体系20 μL。

总需：引物各40 μL（10 μM），探针20 μL（10 μM），加水至2000 μL。

分装至50 μL/管（够2-3次使用），-20°C保存。

4. 引物探针使用的关键技巧

4.1 浓度优化

引物探针浓度需通过实验优化：

引物浓度过高（>1 μM）：非特异扩增，Ct值提前但曲线异常。

引物浓度过低（<0.1 μM）：扩增效率下降，Ct值延迟。

探针浓度：通常为引物的1/2-1，确保荧光信号充足但不浪费。

优化方法：

设置浓度梯度（如引物0.2、0.4、0.6 μM，探针0.1、0.2 μM），检测标准品的Ct值和扩增曲线斜率。

选择扩增效率（E = 10^(-1/slope) - 1）接近100%（90-110%）的组合。

4.2 退火温度调整

退火温度（Tm）由引物序列决定，常用公式：

Tm = 4(G+C) + 2(A+T) (°C)。

实际Tm需通过qPCR仪器梯度测试，推荐范围55-65°C。

新冠检测中，N基因引物Tm通常为58-60°C，若与探针Tm差异>5°C，可能需调整序列。

4.3 污染控制

引物探针易受核酸酶或气溶胶污染：

在专用PCR洁净区配制。

使用阳性对照和无模板对照（NTC）， NTC Ct值>35视为无污染。

定期更换手套，避免交叉污染。

4.4 储存与稳定性

短期：4°C存放1个月，荧光探针需避光。

长期：-20°C可保存6-12个月，-80°C更稳定。

稳定性测试：冻融10次后，检测标准品Ct值变化<0.5，确保质量。

5. 新冠检测中的常见引物探针

新冠病毒（SARS-CoV-2）检测主要基于RT-qPCR，需逆转录RNA为cDNA后扩增。以下是国际和国内推荐的常见引物探针及其特点。

5.1 WHO推荐引物探针

目标基因：E基因（包膜蛋白）、N基因（核衣壳蛋白）。

E基因引物探针（德国Charité设计）：

正向引物：ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCG

反向引物：ATATTGCAGCAGTACGCACACA

探针：FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1

特点：高灵敏度，用于筛查，检测极限约10 copies/反应。

N基因引物探针：

正向引物：CACATTGGCACCCGCAATC

反向引物：GAGGAACGAGAAGAGGCTTG

探针：FAM-ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA-BHQ1

特点：特异性强，确认阳性结果。

5.2 CDC推荐引物探针（美国）

 目标基因：N1、N2区域。

N1引物探针：

正向引物：GACCCCAAAATCAGCGAAAT

反向引物：TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG

探针：FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1

N2引物探针：

正向引物：TTACAAACATTGGCCGCAAA

反向引物：GCGCGACATTCCGAAGAA

探针：FAM-ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-BHQ1

特点：双靶点检测，N1灵敏度高，N2特异性强，检测极限5-10 copies/反应。

5.3 中国CDC引物探针

目标基因：ORF1ab、N基因。

ORF1ab引物探针：

正向引物：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向引物：ACGATTGTGCATCAGCTGA

探针：FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1

N基因引物探针：

正向引物：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

反向引物：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

探针：FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1

特点：适用于国内变异株，双基因检测提高准确性，检测极限约100 copies/mL。

5.4 使用注意事项

稀释浓度：WHO和CDC建议引物0.4 μM、探针0.2 μM，中国CDC推荐0.5 μM引物、0.25 μM探针。

退火温度：N基因通常60°C，ORF1ab可能需62°C，需仪器验证。交叉反应：测试常见呼吸道病毒（如流感、RSV）确保无非特异扩增。

6. qPCR引物探针的优化与故障排查

6.1 优化策略

标准曲线：用已知浓度模板（如质粒）绘制Ct值对数曲线，斜率-3.1至-3.6（E=90-110%）。

熔解曲线：SYBR Green实验中，单一峰值确认特异性。

引物二聚体：通过PAGE电泳或软件（如Primer-BLAST）检测，避免自配对。

6.2 常见问题与解决

无信号：

检查引物探针储存是否降解（用OD260检测浓度）。

确认模板质量（RNA完整性RIN>7）。

假阳性：

检查NTC，清洗仪器，排除污染。

Ct值不一致：

校准移液器，确保加样精度（CV<2%）。

重复稀释，验证储备液浓度。

7. 新冠检测中的实践案例

以中国CDC的ORF1ab和N基因检测为例：

样本：咽拭子RNA提取，浓度50 ng/μL。

体系：20 μL反应，含10 μL 2×Master Mix、0.4 μL引物（10 μM）、0.2 μL探针（10 μM）、2 μL模板。

程序：50°C逆转录30 min，95°C预变性2 min，95°C 15 s、60°C 45 s，40循环。

结果：Ct<35为阳性，35-38为可疑，>38为阴性，双基因阳性确诊。

实验中，N基因Ct值通常比ORF1ab低2-3，反映其更高表达量。若仅一基因阳性，需重复检测或测序确认。

8. 未来展望

随着qPCR技术进步，引物探针的使用也在优化：

多重检测：开发多色荧光探针（如FAM、VIC、ROX），一次检测多种病原体。

自动化：液处理机器人提高稀释和加样精度，减少人为误差。

便携式qPCR：如Cepheid GeneXpert，简化新冠检测流程。

9. 结论

 qPCR引物探针的稀释与使用是实验成功的基础。从储备液配制到工作浓度优化，再到新冠检测中的特异性应用，每一步都需精准操作。通过掌握稀释计算、浓度调整和污染控制技巧，并熟悉WHO、CDC等推荐的引物探针序列，使用者可显著提高qPCR的可靠性和效率。未来，随着自动化和多重检测技术的发展，qPCR将在公共卫生和精准医疗中发挥更大作用。你会了吗？