1. 实时荧光定量PCR概述

实时荧光定量PCR（qPCR）是一种基于PCR反应的定量技术，它利用荧光探针或染料标记扩增产物，在扩增过程中实时监测荧光信号的变化，进而测定目标核酸的初始拷贝数。在PCR扩增过程中，随着目标序列的扩增，产生的荧光信号会逐步增加，实时监测这些信号变化，可以对目标分子的数量进行定量分析。与传统的PCR方法（如终点检测）相比，实时定量PCR能够在扩增过程中实时获取数据，从而提高了检测的灵敏度和准确性。

实时定量PCR的一个重要特点是它通过阈值循环（Ct值）来表征目标核酸的起始拷贝数。Ct值是指在PCR反应过程中，当荧光信号超过预设阈值时所对应的循环数。Ct值越小，说明目标核酸的初始量越高；反之，Ct值越大，说明初始量较低。

1.1 实时荧光定量PCR的工作原理

实时荧光定量PCR通过在PCR扩增过程中监测荧光信号的变化来实现定量。荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比，因此，在PCR反应的每个循环中，荧光信号的增加反映了目标分子的扩增量。

实时定量PCR一般有两种荧光监测方法：荧光染料法和荧光探针法。荧光染料法使用SYBR Green等染料与扩增产物结合，通过染料的荧光信号变化来监测PCR产物；而荧光探针法则使用特异性的荧光探针来检测目标序列的扩增产物。

2. 常用的实时定量PCR试剂与技术

实时定量PCR的试剂主要有TaqMan试剂和SYBR Green I染料两种。它们各有优缺点，适用于不同类型的实验需求。

2.1 TaqMan试剂

TaqMan试剂是一种基于荧光探针的实时PCR检测技术。该方法使用特定的荧光标记探针来识别目标DNA序列。在PCR扩增过程中，探针通过Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性被降解，释放出荧光信号。通过监测荧光信号的变化，可以实时定量目标序列的扩增量。

2.1.1 TaqMan方法的工作原理

TaqMan方法依赖于特异性荧光探针的设计。每个探针由三部分组成：一个荧光报告基团（如FAM），一个淬灭基团（如TAMRA）和一个核苷酸序列。当探针保持完整时，淬灭基团会通过荧光共振能量转移（FRET）作用，抑制报告基团的荧光信号。只有在探针与目标序列结合后，Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性会将探针切除，分离报告基团与淬灭基团，从而释放出荧光信号。

TaqMan方法的优点在于其高度的特异性，因为探针能够准确地识别目标序列并在其上发生水解。与传统的染料法不同，TaqMan方法能够避免对非特异性扩增产物的检测，因此能够提供更加可靠的定量结果。

2.1.2 TaqMan试剂的应用

TaqMan试剂可用于以下几种定量检测：

RNA定量：包括一步法RT-PCR和两步法RT-PCR。

DNA/cDNA定量：用于基因表达的分析。

等位基因检测：TaqMan探针能够用于检测等位基因的多态性。

正负检测：通过内部PCR控制（IPC）进行正负对照检测。

2.1.3 TaqMan试剂的优缺点

优点：

高度特异性，能够避免非特异性产物的影响。

无需后期反应处理，减少了实验步骤和操作误差。

可以通过不同的荧光报告基团标记多个探针，从而实现多重检测。

缺点：

需要针对每个目标序列合成特定的探针，因此成本较高。

实验设计时需要考虑探针的优化和验证，增加了实验的复杂性。

2.2 SYBR Green I染料试剂

SYBR Green I染料法是一种基于染料与双链DNA结合的实时PCR检测方法。SYBR Green I染料能够与任何双链DNA结合，并在与DNA结合时发出荧光。PCR扩增过程中，每增加一个双链DNA分子，SYBR Green I染料的荧光信号就会增强，从而反映扩增产物的量。

2.2.1 SYBR Green I染料法的工作原理

SYBR Green I染料是一种高度特异性的双链DNA结合染料。在PCR过程中，随着DNA链的扩增，SYBR Green I染料与双链DNA结合，产生荧光信号。随着PCR反应的进行，荧光信号的强度会逐渐增加，反映了DNA产物的数量。与TaqMan方法不同，SYBR Green I染料法没有使用探针，而是直接依赖于染料与双链DNA的结合来进行检测。

2.2.2 SYBR Green I染料法的应用

SYBR Green I染料法可以用于：

RNA定量：包括一步法RT-PCR和两步法RT-PCR。

DNA/cDNA定量：用于基因表达分析。

基因突变检测：用于检测基因突变或多态性。

2.2.3 SYBR Green I染料法的优缺点

优点：

成本较低，不需要合成特定的探针。

可以检测所有双链DNA，适用于多种类型的实验。

适用于基因表达分析、突变检测等多种应用。

缺点：

特异性较差，SYBR Green I染料会与所有双链DNA结合，因此可能会检测到非特异性扩增产物，导致假阳性结果。

需要对引物进行优化，避免产生非特异性扩增产物。

3. 实时荧光定量PCR的定量方法

3.1 定量检测的基本概念

定量检测是实时荧光定量PCR（qPCR）的一种应用。通过实时监测PCR过程中荧光信号的变化，可以定量目标核酸分子的初始量。定量PCR的方法主要有两种：绝对定量和相对定量。

3.1.1 绝对定量

绝对定量是指通过标准曲线的方法，测定样品中目标核酸的确切拷贝数。在这种方法中，需要使用已知浓度的标准品来构建标准曲线，然后根据标准曲线计算样品中目标分子的数量。

3.1.2 相对定量

相对定量用于比较不同样本中目标基因的表达量，通常采用比较CT法。该方法通过比较目标基因与内源性对照基因（如GAPDH、β-actin等）的表达差异，得出目标基因的相对表达量。相对定量可以用来分析基因表达变化、药物处理效果等。

3.2 定量分析的常用术语

在定量PCR实验中，常见的术语包括：

扩增子：PCR过程中生成的DNA片段。

扩增曲线：基于荧光信号与循环数的关系，绘制的曲线。

Ct值：阈值循环（threshold cycle）值，指荧光信号超过阈值时的PCR循环数。

基线：PCR反应的初始阶段，荧光信号尚未增加。

ΔCt值：目标基因和内源性对照基因的CT值差异。

3.3 标准曲线法与比较CT法

3.3.1 标准曲线法

标准曲线法是绝对定量的核心，依赖于使用已知浓度的标准品构建标准曲线。标准品的浓度范围应覆盖样本中目标核酸的预期浓度，通过与标准曲线的对比，可以准确测定样本中目标分子的数量。

3.3.2 比较CT法

比较CT法是相对定量的常用方法，通过比较目标基因与内源性对照基因的CT值，计算目标基因的相对表达量。该方法通常用于分析基因表达的变化，例如比较不同条件下的样本或不同处理组之间的差异。

4. 实时荧光定量PCR的注意事项与优化策略

4.1 样本的质量与处理

实时荧光定量PCR的准确性受到样本质量的显著影响。RNA样本的降解或DNA样本的污染都可能导致结果偏差。因此，在实验前需要确保样本的质量，并进行适当的处理。例如，RNA样本在提取时需要使用RNA酶抑制剂，避免RNA降解。

4.2 引物和探针的设计

引物和探针的设计对于实时PCR实验的成功至关重要。设计时需要考虑引物的特异性、二聚体的形成、GC含量等因素。高质量的引物和探针能够有效避免非特异性扩增和背景信号，确保定量结果的准确性。

4.3 实验的优化

在实时PCR实验中，为了确保实验结果的准确性和重复性，需要对实验条件进行优化。例如，优化PCR反应体系中的酶、缓冲液、Mg2+浓度等因素，可以提高反应的效率和特异性。此外，实验过程中使用的反应板、荧光检测设备等也需要进行校准，以确保数据的准确性。

5. 总结

实时荧光定量PCR是一种强大而精准的定量分析技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因拷贝数测定等领域。通过选择合适的试剂（如TaqMan试剂或SYBR Green I染料）并优化实验条件，可以实现高效、精确的定量检测。对于科研和临床实验来说，实时荧光定量PCR的应用无疑是不可或缺的技术之一。